Análise proteômica de embriões zigóticos e endosperma em sementes de Coffea arabica.

Durante o desenvolvimento da semente de café, proteínas vão sendo depositadas, predominantemente nos cotilédones e no endosperma. As proteínas de reserva 11S são as globulinas mais abundantes na semente de café agindo como fonte de nitrogênio nas reações de torra e garantindo o sabor e aroma característicos. Este estudo teve como objetivo analisar o perfil de proteínas expressas em endosperma e embrião zigótico de sementes de café. Proteínas foram extraídas da semente inteira, e também do endosperma e embrião de café, isoladamente. Em seguida, as proteínas foram analisadas por eletroforese bidimensional (2-DE) e posteriormente por espectrometria de massa. Os spots mais abundantes observados no gel de proteínas de semente inteira foram excisados, tripsinizados e identificados como subunidades da proteína 11S através de espectrometria de massa. Spots com o mesmo pI e massa molecular foram também observados no perfil de proteínas do endosperma e embrião, indicando que a proteína 11S é também muito expressa nesses tecidos. Foi possível identificar algumas destas proteínas, que mostraram identidade com a proteína de reserva 11S de café. Foi obtida uma cobertura de seqüência de peptídeos de aproximadamente 20% de toda a proteína 11S. Duas proteínas diferenciais presentes no endosperma foram também analisadas por espectrometria de massa e identificadas através de seqüenciamento de novo como uma glubulina da mesma família da 11S (Cupin superfamily) e uma proteína alergênica (Pru ar 1)

Espectrometria de massa de razões isotópicas

Tese de doutoramento em Química (Química Analítica), apresentada à Universidade de Lisboa através da Faculdade de Ciências, 2008As técnicas isotópicas são metodologias muito poderosas usadas na detecção da adulteração de géneros alimentícios. O acoplamento de cromatógrafos em fase gasosa (GC) a um espectrómetro de massa de razões isotópicas (IRMS), com uma interface de combustão (GC/C/IRMS) para determinação das razões isotópicas tais como 13C/12C e15N/14N é relativamente recente e apresenta a vantagem de fornecer valores de razões isotópicas dos diferentes componentes de misturas complexas. Contudo, não existem ainda Materiais de Referência Certificados (MRC) que validem todo o sistema de GC/C/IRMS. Com vista a reforçar a legislação comunitária existente, é essencial que os métodos isotópicos usados se baseiem em procedimentos experimentais bem definidos e cuidadosamente validados, que tornem possível a comparação directa e clara de resultados entre laboratórios da Comunidade e entre laboratórios de todo o mundo (rastreabilidade dos resultados). A finalidade do presente trabalho é demonstrar a exequibilidade de utilização de uma mistura do tipo Grob, i.e., baseada na mistura de Grob (vulgarmente utilizada na verificação de colunas na técnica de GC) como material de referência para aplicação na técnica de GC/IRMS. Foram seleccionados onze compostos (alguns dos quais pertencentes à mistura de Grob) nomeadamente, 1-octanol, 2,6-dimetilfenol, 2,6-dimetilanilina, dodecano, decanoato de metilo, dodecanoato de metilo, nonanal, N,N,3,5-tetrametilanilina, 4-(N,N-dimetilamino) benzoato de etilo, 2 (metilamino)benzoato de metilo e vanilina. Numa primeira fase do trabalho que aqui se apresenta realizou-se o Ensaio Circular para determinação da razão isotópica de δ13C pela técnica hifenada análise elementar - espectrometria de massa de razões isotópicas, EA/IRMS, de todos os compostos puros e das amostras resultantes dos testes de homogeneidadede e de estabilidade no curto prazo ou de degradação acelerada (resistência a choques térmicos e por irradiação com luz UV) e de estabilidade no longo prazo. Estes testes foram realizados segundo o guia Bureau Communitaire de Référence (BCR) para a produção de Materiais de Referência Certificados. Para comparação com a técnica de EA/IRMS determinaram-se as razões isotópicas δ13C nos compostos puros utilizando a técnica de GC/C/IRMS com duas colunas cromatográficas diferentes, uma polar e outra não polar. Numa segunda fase, os compostos puros e a mistura do tipo Grob seleccionada, constituída por sete compostos (1-octanol, 2,6-dimetilanilina, dodecano, decanoato de metilo, dodecanoato de metilo, N,N,3,5-tetrametilanilina e 2 (metilamino)benzoato de metilo) foram submetidos a um Ensaio de Certificação Simulado (ECS) a fim de se obterem os valores de consenso e valores da exactidão e da precisão para a técnica de GC/C/IRMS. No final, foi possível obter valores de consenso de δ13C (e não certificar, uma vez que se trata de um estudo de exequibilidade e não de certificação) para a certificação dos onze compostos puros, para a técnica de EA/IRMS. E também valores de consenso de δ13C para a mistura constituída pelos sete compostos acima referidos e ainda para a vanilina pura, para a técnica de GC/IRMS. Foi ainda possível avaliar o desempenho da técnica de GC/IRMS e compará-lo com a técnica de EA/IRMS, tomada como método de referência, e foram construídas Folhas de Dados Técnicos ( Technical Data Sheets ) que compilam os valores das razões isotópicas δ13C com uma estimativa da sua incerteza e informação sobre o tamanho das unidades a serem produzidas, o transporte e as condições de armazenamento dos futuros candidatos a MRCs. Este trabalho foi realizado ao abrigo de um projecto financiado pela Comunidade Europeia dentro do Programa Competitive and Sustainable Growth , do 5º Programa Quadro (1998-2002).Stable isotope analyses are powerful techniques for the detection of food adulteration. One of the most recent additions to this field, the GC/C/IRMS technique is becoming increasingly used as a tool for authentication. This measuring system that combines the separation power of gas-chromatography with an isotope ratio mass spectrometer (using a combustion interface), has the added advantage of directly providing isotope ratio determinations of components of a complex mixture. Neverthelesss there are not yet any available Certified Reference Materials to validate the GC/C/IRMS system. This study was directed towards the investigation of suitable compounds to be used as stable isotope reference materials for gas chromatography combustion isotope ratio mass spectrometry (GC/C/IRMS) calibration. Eleven organic compounds were selected, including, from those used in the Grob mixture (a mixture with different polarities and funcionalities used to test the performance of the GC columns) namely 1-octanol, 2,6-dimethylphenol, 2,6-dimetylaniline, dodecane, methyl decanoate, methyl dodecanoate, nonanal, N,N,3,5-tetramethylaniline, ethyl 4-(N,N dimethylamino)benzoate, methyl 2-(methylamino)benzoate and vanillin. The latter is very important in the food authenticity domain. All the compounds were individually assessed for homogeneity, short-term stability and long-term stability by means of EA/IRMS, as required by de Bureau Communitaire de Référence (BCR) Guide for Production of Certified Reference Materials. The results were compared with the GC/C/IRMS measurements using both polar and non-polar columns, and the final mixture of seven selected compounds namely 1 octanol, 2,6-dimethylaniline, dodecane, methyl decanoate, methyl dodecanoate, N,N,3,5 tetramethylaniline and methyl 2 (methylamino)benzoate underwent a further Simulated Certification Exercise (SCE) in order to assess limits of accuracy and reproducibility for GC/C/IRMS technique. Overall, the results from this work have shown that is feasible to obtain reference values for the eleven selected compounds for the EA/IRMS technique. Regarding the GC/IRMS measurements, it was shown that it is possible to obtain a mixture of compounds of known δ13C values, coherent GC/IRMS results (deviations from EA values are within the precision of the GC/C/IRMS method) as well as for vanillin. Technical Data Sheets have been drafted for each one of the eleven compounds and for the mixture and include the name of compound or compounds in the mixture, size of sample, procedure for mixing, proposed packaging and the target values for δ13C to indicate for certification and a preliminary associated uncertainty. This work was carried out under a shared-cost RTD EU project financed under the Fifth Framework Programme of the European Community, within the Competitive and Sustainable Growth Programme , Measurements and Testing Activity (1998-2002)

Avaliação da correção de sinais de fundo causados pelos íons diatômicos Ar2 + e CN+ em ICP-MS com interface CRI.

Íons poliatômicos são formados durante os processos de atomização no plasma de argônio e transferência da nuvem atômica para o espectrômetro de massa, gerando interferências isobáricas. Esses íons são particularmente problemáticos se as concentrações dos analitos estão próximas aos limites de detecção da técnica de espectrometria de massa acoplada ao plasma indutivo, ICP-MS. A formação de íons diatômicos é mais abundante, entre os quais se destacam o dímero do argônio 40Ar2 + (massa/carga, m/z = 80 ? 80Se+) e os íons 12C15N+ e 13C14N+ (m/z = 27 ? 27Al+). Dessa forma, a proposta deste trabalho foi avaliar o desempenho da interface de colisão e reação (CRI) para a correção de sinais de fundo nas razões m/z 27 e 80

Desenvolvimento de metodologia analítica para determinação de resíduos de medicamentos veterinários em carne bovina.

Objetivo de desenvolver e avalidar uma metodologia analítica, empregando a despersão da matriz em fase sólida (DMFS), seguida pela cromatografia gasosa acoplada á espectrometria de massa (GG-MS), na análise de resíduos de medicamentos veterinários ( carrapticidas), clorfensvinfos, fipronil cipermetrina, os quais são aplicados no rebanho bovino, utilizando como matriz de estudo a carne bovina

Identificação taxonômica de leveduras ambientais por espectrometria de massa MALDI-TOF.

O objetivo deste trabalho foi identificar, por MALDI-TOF MS, 99 leveduras isoladas de uvas cultivadas no Vale do São Francisco/PE para inseri-las na Coleção de Leveduras do Centro Nacional de Pesquisa de Uva e Vinho (WDCM 1056)

Determinação simultânea de cd, fe e ni em lodo de esgoto em suspensão por espectrometria de absorção atômica de alta resolução com fonte contínua com atomização em forno de grafite

TCC (graduação) - Universidade Federal de Santa Catarina. Centro de Ciências Físicas e Matemáticas. Curso de Química.Neste trabalho foi desenvolvido um método para determinação simultânea de Cd, Fe e Ni no ambiente espectral vizinho à linha de ressonância de Cd em 228,802 nm, utilizando também as linhas secundárias de Fe (228,725 nm) e Ni (228,998 nm) para análise por espectrometria de absorção atômica de alta resolução com fonte contínua em forno de grafite (HR-CS GF AAS), o que não seria possível em AAS com fonte de linha. Foram analisadas amostras certificadas de referência de lodo de esgoto doméstico e industrial, que foram moídas a diâmetro de partícula ≤ 50 μm e pesadas em alíquotas de 5 a 15 mg para o preparo das suspensões, seguindo-se a adição de HF e HNO3 nas concentrações de 0,2 mol L-1 e 0,7 mol L-1, respectivamente, em um volume final de 10 mL. A determinação simultânea foi realizada utilizando um programa de temperatura curto de apenas 30 s, sem etapa de pirólise e com atomização em dois estágios, em função da diferença de volatilidade entre Cd, Fe e Ni. A calibração foi efetuada utilizando padrões aquosos, visto que o comportamento dos analitos em solução aquosa e nas amostras mostrou-se semelhante. As temperaturas de atomização otimizadas foram de 1300 ºC para Cd e 2300 ºC para Fe e Ni. Foi obtida boa concordância com os valores certificados de lodo de esgoto doméstico e industrial para Cd e Ni e informados para Fe, em nível estatístico de 95%. A precisão foi expressa a partir do desvio padrão relativo (RSD) para os três elementos, sendo que os valores obtidos encontram-se na faixa de 1,4 – 13%. O método resultou em limites de detecção de 0,03; 90 e 3 μg g-1 para Cd, Fe e Ni, respectivamente

Espectrometria de massa: uma aplicação biológica

A partir de interpretações sobre a física de um campo eletromagnético sobre partículas eletricamente instáveis, foi desenvolvida uma técnica analítica de alta precisão que possui imensa aplicação na área biológica. Esta técnica é a espectrometria de massa que pode ser entendida como uma grande ferramenta de aplicação biológica pelo fato de, nas últimas seis décadas, ter representado um método eficiente para a identificação e quantificação de compostos químicos bioativos. Alguns exemplos de aplicação biológica e biomédica podem ser observados nos testes de doping, onde se procura a presença de drogas estimulantes, na análise residual de pesticidas em alimentos, nas análises de acúmulo de metais pesados no organismo, uma vez que podem desencadear neuropatias periféricas, e no seqüenciamento de proteínas que representam um importante papel na descoberta de fenômenos fisiológicos e patológicos associados às atividades protéicas do genoma humano. A espectrometria de massa é, sem dúvida, uma potente instrumentação analítica que tem alcançado mais espaço no mundo científico e tecnológico por solucionar problemas e gerar muitas perspectivas de progresso em análises químicas

Caracterização de heteropolissacarídeos por espectrometria de massa

Mestrado em Bioquímica e Química dos AlimentosO trabalho de investigação elaborado no âmbito desta dissertação de Mestrado, teve como objectivo a aplicação da Espectrometria de Massa (MS) utilizando métodos de ionização por electrospray (ESI) e ionização por desorção por laser assistida por matriz (MALDI), para a caracterização dos heteropolissacarídeos gelanas e xilanas. Neste trabalho foi efectuada a caracterização de duas gelanas, uma gelana comercial e uma gelana modificada JB3, por ESI MS e espectrometria de massa tandem (MS/MS e MSn). Os heteropolissacarídeos de ambas as gelanas foram submetidos a hidrólise parcial ácida com TFA e, os oligossacarídeos obtidos foram fraccionados por cromatografia de exclusão molecular. Estes oligossacarídeos foram posteriormente identificados por ESIMS e, caracterizados por ESI-MS/MS e MSn. A caracterização estrutural foi obtida por fragmentação dos iões [M+Na]+ identificados nos espectro de ESIMS. Tal análise permitiu identificar em ambas as gelanas, a unidade estrutural típica destes polímeros, a qual é constituída por dois resíduos de Glc, um resíduo de GlcA e um resíduo de Rha, com a sequência GlcGlcAGlcRha. No entanto, verificaram-se também diferenças estruturais entre ambas as gelanas, essencialmente no que diz respeito a grupos substituintes. Assim, verificou-se a presença de grupos glicerato apenas na constituição da gelana modificada, e ausência de grupos acetilo em ambas as gelanas. Xilianas da madeira de Paulowia elongata / Paulownia fortunei foram, no âmbito deste trabalho, isoladas a partir da madeira e caracterizadas por análise de açúcares, H1 RMN e espectrometria de massa (ESI-MS, MS/MS e MALDI-MS). A análise destes resultados revelou que estas xilanas apresentam uma cadeia principal constituida maioritariamente por unidades de (1®4)-b-Dxilopiranose parcialmente acetiladas e ramificada com resíduos de MeGlcA e GlcA. Para a identificação da estrutura primária da xilana, esta foi sujeita a hidrólise parcial ácida e os xilo-oligossacarídeos (XOS) daí resultantes foram posteriormente separados por LEX-SEC. As fracções obtidas foram analisadas por ESI-MS, MS/MS e MALDI-MS. Nos espectros de ESI-MS foram identificadas séries de XOS neutros de pequeno grau de polimerização (DP) e com diferentes graus de acetilação (Xyl2-4Ac0-3), e por MALDI-MS foi possivel identificar XOS neutros, acetilados e não acetilados com maior DP (Xyl6-20Ac0- 9). Neste trabalho foi possível ainda identificar XOS ácidos, através de ESI-MS e MALDI-MS, correspondentes a três séries distintas de XOS, que se podem representar por: Xyl1-11Ac0-7MeGlcA; Xyl5-12Ac0-3MeGlcA2 e Xyl6-20Ac9- 17MeGlcAGlcA. A identificação de XOS neutros com elevado DP, tais como Xyl20Ac10, leva-nos a sugerir que os resíduos ácidos se apresentam distribuidos pela cadeia de xilana, de uma forma irregular. Mais uma vez a espectrometria de massa revelou-se de extrema importância para a identificação e caracterização estrutural de oligossacarídeos. ABSTRACT: The main purpose of the work developed during this study was the application of mass spectrometry (MS) with ionisation methods of elctrospray (ESI) and matrix assisted laser desorption ionisation (MALDI) for the characterisation of the heteropolysaccharides gellans and xylans. In the present work, we compared two different gellans: a commercial gellan and a modified gellan. These heteropolysaccharides were hydrolysed (by acidic hydrolysis) and the oligosaccharides obtained were fractionated by size exclusion chromatography. The fractions obtained were further analysed by MS. The mass spectrometers used in that analysis were ESI-QTOF and ESIlinear ion trap. The structural characterisation was obtained by the analysis of the MS/MS and MSn spectra of [M+Na] + ions identified in the ESI-MS spectra The results showed that both gellans are comprised by a tetrasaccharide repeat unit composed of two molecules of D-glucose (D-Glc), one of Lrhamnose (L-Rha) and one of D-glucuronic acid (D-GlcA),with the following sequence GlcGlcAGlcRha. However some structural differences between the two gellans were detected. The modified gellan showed the presence of glyceryl groups as ramifications, but this is absent in commercial one. Acetyl groups were found to be absent in both gellans. As a part of this work, xylans were isolated from holocellulose of hybrid Paulownia elongate / Paulownia fortunei wood with dimethyl sulfoxide. The composition and the structural features of xylan were elucidated by wet chemistry, NMR (1H NMR, TOCSY, HSQC) and by MS. It was found that Paulownia xylan backbone is constituted of partially acetylated (1®4)-linked b- D-xylopyranosyl units and substituted with GlcA and/or MeGlcA. To identify xylan primary structure, the isolated xylan was also submitted to acid hydrolysis and xylo-oligosaccharides (XOS) obtained were fractionated by LEX-SEC in fractions that comprise neutral or acidic XOS. Structural characterisation of both neutral and acidic XOS were obtained by mass spectrometry with ESI and MALDI (ESI-MS, ESI-MS/MS and MALDI-MS).The neutral XOS identified by ESI-MS correspond to non-substituted XOS with different acetylation degree (Xyl2-4Ac0-3). MALDI-MS allowed the identification of neutral XOS with rather higher DP (Xyl6-20Ac0-9). The acidic fractions, in the ESI-MS and MALDI-MS spectra, revealed the presence of acetylated and non-acetylated acidic XOS, with one and two acidic residues that can be summarized in three different series: Xyl1-11Ac0-7MeGlcA, Xyl5-12Ac0-3MeGlcA2 and Xyl6-20Ac0-17MeGlcAGlcA. The identification by MALDI-MS of large fragments of neutral XOS, such as Xyl20Ac8, suggested that the acidic uronic residues may be irregularly distributed along the xylan backbone

Identificação de bactérias por espectrometria de massa

Mestrado em Bioquímica - Métodos BiomolecularesIdentification of bacteria is a major part of the diagnosis of a pathogenic infection. In order to positively and confidently identify the bacteria, different techniques can be applied. These techniques are based on different principles, such as phenotypic differences, DNA sequences comparison, mass spectrometry (MALDI-TOF) and the protein content of the bacteria. From comparison of MALDI-TOF for bacteria identification with the other methodologies available, several advantages can be highlighted: lower cost per identification, faster results and higher discrimination power. This work focus on the development of a new application capable of identifying bacteria using MALDI-TOF mass spectrometry. It started by the protein extraction of the samples and the acquisition of the mass profiles of those bacteria. This work proceeded with the development of an application to identify bacteria by comparing the mass profile of an unknown sample with the mass profiles of the bacteria in our database. Using the developed application it was possible to identify both Gram-positive and Gram-negative bacteria to the strain-level. When an identification to strain-level was not possible, it was possible to identify the bacteria to the species-level and in the case the database did not contain an entry of the same species as the sample, the score values were low enough to disregard a possible identification resulting in a low false-positive rate.A identificação de bactérias é um dos principais componentes do diagnóstico de infeções patogénicas. De modo a se conseguir obter uma identificação podem ser aplicadas diferentes técnicas, tais como, diferenças de fenótipo, comparação de sequências de ADN e a comparação do conteúdo proteico das bactérias. Quando se compara a identificação bacteriana com recurso à espectrometria de massa MALDI-TOF com as metodologias alternativas, podemos destacar diversas vantagens: menor custo por análise, menos tempo para obtenção de resultados e um maior poder discriminatório. Este trabalho tem como foco o desenvolvimento de uma nova aplicação capaz de identificar bactérias com recurso a espectrometria de massa. O trabalho foi iniciado com a extração proteica das amostras e a aquisição dos perfis de massa dessas bactérias. De seguida, prosseguiu-se com o desenvolvimento de uma aplicação para a identificação de bactérias com base na comparação dos perfis de massa da amostra e dos perfis contidos na base de dados. Usando a aplicação desenvolvida conseguiu-se identificar corretamente tanto bactérias Gram-positivas como Gram-negativas. Quando uma identificação da estirpe não foi possível, a aplicação permitiu a identificação da espécie bacteriana e no caso de a base de dados não conter nenhuma entrada que correspondesse a estirpe ou espécie da amostra, os scores obtidos eram suficientemente baixos para uma eventual identificação ser descartada, resultando assim numa baixa taxa de falsos positivos